一、?原理? 本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測水產(chǎn)和雞肉等**樣本中的己烯雌酚，在微孔條上預(yù)包被上偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性免*化學(xué)反應(yīng)的原理來進(jìn)行的，樣本中的己烯雌酚和微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚的抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣品中的己烯雌酚含量與樣品的吸光度值呈反比，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出己烯雌酚含量。 ? 二、?試劑盒技術(shù)指標(biāo)： 試劑盒靈敏度：??????????0.1ppb 樣本檢測下限： **（蝦、魚）?????????? 0.1ppb 豬肉/肝 雞肉/肝 ?????????? 2ppb 飼料 ???????????????????? 20ppb 尿液 ???????????????????? 0.6ppb 回收率： 飼料????????????????????? 90±10％ **????????????????????? 85±10％ 尿液????????????????????? 80±10％ 交叉反應(yīng)率： 己烯雌酚????????????????? 100％ 雙烯雌酚 ???????????????? 35％ 己烷雌酚? ??????????????? 10％ 己炔雌二醇???????????? ???<0.1％ 雌三醇???????????????? ???<0.1％ ? 三、試劑盒組成 1．酶標(biāo)板：96T/8孔 2．標(biāo)準(zhǔn)品液： 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb（1.0mL/瓶） 3．酶標(biāo)記物??????????? 12mL 4．抗體工作液????????? 7mL 5．底物緩沖液????????? 7 mL 6．底物液????????????? 7 mL 7．終止液????????????? 7 mL 8．20倍濃縮洗滌液???  50 mL???? 用去離子水稀釋到1000 mL 9．20倍濃縮復(fù)溶液???? 12mL???? 用去離子水稀釋到240 mL ? 四、樣本前處理步驟 樣本處理前須知： 1．實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。 2．實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 樣本前處理需配制： 配液1：6M H**O4?? 100mL?? 濃H**O4（含量85％） 加去離子水150mL混合均勻 配液2：1M NaOH??  4g ???? NaOH ????加去離子水100mL溶解 配液3：2M NaOH??  8g??????  NaOH ??加去離子水100mL溶解 配液4：乙腈-**? ? 80mL????? 乙腈??? 加入**20mL混合均勻 ? 樣本的處理： （a）飼料樣本 1．稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8mL乙腈，振搖10min，15℃，3000g以上，離心10min； 2．取2mL上清液，60℃氮?dú)?空氣吹干； 3．加入0.5mL氯仿，渦動(dòng)20s，加入2mL 1M NaOH，渦動(dòng)30s，3000g以上，離心5min； 4．取1mL上清液，加入100μL 6M H**O4，渦動(dòng)5s； ? 不同樣本按如下方法稀釋： 配合料：取50μL，加入950μL的復(fù)溶液，渦動(dòng)混勻，取50μL /孔用于檢測。 濃縮料/預(yù)混料：取25μL，加入975μL復(fù)溶液，渦動(dòng)混勻，取50μL /孔用于檢測。取50μL用于分析。 配合料稀釋倍數(shù)：100?????? 濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù)：200? （b）**（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚） 1．稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6mL乙腈-**，振搖10min，15℃，3000g以上，離心10min。 2．取3mL上清液，60℃氮?dú)?空氣吹干。 加入0.5mL氯仿，渦動(dòng)20s，加入2mL 2M NaOH，渦動(dòng)30s，3000g以上，離心5min。 3．取1mL上清液，加入200μL 6M H**O4，渦動(dòng)5s。 4．加入3mL乙腈萃取，振蕩10min，室溫3000g以上，離心10min，取上層有機(jī)相， 60℃氮?dú)?空氣吹干。 用1mL復(fù)溶液溶解干燥的殘留物。 ? 不同樣本按如下方法稀釋： 蝦魚：直接取50μL水相用于檢測。稀釋倍數(shù)：2 豬肉/肝、雞肉/肝：取50μL水相加入450μL稀釋后的復(fù)溶液，渦動(dòng)均勻；取50μL用于檢測。 稀釋倍數(shù)：20 （c）尿液 1．取2mL尿液到離心管中，室溫3000g以上，離心10min，直至清亮； 2．移取1mL清亮尿液至離心管中，加入1mL　1M NaOH強(qiáng)烈振蕩5min； 3．加入100μL? 6M H**O4，渦動(dòng)30 s； 4．再加入8mL氯仿進(jìn)行萃取，振蕩10min。15℃，3000g以上，離心10min； 5．去掉上層的水相，取下層有機(jī)相4 mL，60℃氮?dú)?空氣吹干； 6．用3mL稀釋后的復(fù)溶液干燥的殘留物； 取50μL 用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：6 ? 五、操作步驟 1． 將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2． 按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。 3． 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL /孔，然后加入抗體工作液50μL /孔，再振蕩混勻，用封板膜蓋板，室溫反應(yīng)30min。 4． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。 5． 加入酶標(biāo)記物100μL /孔，用封板膜蓋板，室溫反應(yīng)20min。 6． 洗板4-5次，每次浸泡30秒，拍干。 7． 顯色：每孔加入底物緩沖液50μL，再加底物液50μL，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色10min。 8．測定：每孔加入終止液50μL，輕輕振蕩勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（在20min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值。 ? 六、結(jié)果判定 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實(shí)際濃度。 ? 七、注意事項(xiàng) 1. 終止液為2M**，避免接觸皮膚。 2. 不要使用已過有效日期的孔雀石綠檢測試劑盒；不同批次、不同試劑盒之間的試劑等內(nèi)容不可混用，以免降低靈敏度。 3. 0標(biāo)準(zhǔn)液的A450nm<0.6時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)，請(qǐng)勿使用。 4. 顯色劑變藍(lán)，表明已變質(zhì)，請(qǐng)勿使用。 ? 八、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。