一、原理 本試劑盒采用固相酶聯(lián)免*吸附ELISA原理，通過(guò)黃曲霉***B1(AFB1)抗原和曲霉***B1(AFB1)抗體，待測(cè)抗原的競(jìng)爭(zhēng)免*反應(yīng)，以及酶的催化顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)AFB1，***是靈敏度高，特異性好，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果易判讀，適用于食品、飼料及相關(guān)原料中AFB1的定量檢測(cè)。?? ? 二、試劑盒技術(shù)指標(biāo) 試劑盒靈敏度：0.1 ppb 回收率：??谷物/飼料中AFB1回收率?? 95％±15％ 變異系數(shù)：批內(nèi)變異系數(shù)<10％，批間變異系數(shù)<15％。 ? 三、試劑盒 組 成 1．微量測(cè)試孔：? 96T/8孔 2．標(biāo) 準(zhǔn) 液×6瓶：（1 mL/瓶） 0 ppb? 0.05 ppb? 0.15 ppb  0.45 ppb  1.35 ppb  4.05 ppb 3．抗體工作液???????????????? 7 mL 3．酶標(biāo)記物????????????????? 12 mL 4．底物緩沖液???????????????  7 mL? 5．底物液　?????????????????  7 mL? 6．終止液???????????????????  7 mL 7．20倍濃縮洗滌液????? ????? 50 mL?? 加蒸餾水后稀釋到1000 mL。 ? 四、樣本前處理步驟 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：配制60 ％甲醇水溶液（v/v，60：40）和20 ％甲醇水溶液（v/v，20：80）。 注意：請(qǐng)精確配制上述溶液，以免影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性。 1 .?脂肪含量低的固體樣品（如大米、玉米、小麥和飼料等） 1、稱(chēng)取5 g 粉碎樣品于100 mL帶塞三角瓶?jī)?nèi)，準(zhǔn)確加入25 mL 60％甲醇水溶液。 2、將加入了甲醇水溶液的樣品放入振蕩器內(nèi)（或用手強(qiáng)力振蕩），充分振蕩3 min后，用濾紙過(guò)濾，收集濾液。 3、取濾液2 mL，加入6 mL 20 ％甲醇水溶液，混勻，用whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾，此為樣品待檢液。 2．醬油、醋 1、稱(chēng)取5 g樣品于25 mL小燒杯中，用10 mL蒸餾水將試樣轉(zhuǎn)移到125 mL分液漏斗中，加入25 mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。 2、放出下層三氯甲烷層，取5 mL于20 mL蒸發(fā)皿中，65 ℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入5 mL 60％甲醇水溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解。 3、取溶解液2 mL，加入6 mL 20％甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 3．食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等） 1、稱(chēng)5 g油樣于25 mL小燒杯中，用20 mL石油醚或正乙烷分次將試樣轉(zhuǎn)移至125 mL分液漏斗中，準(zhǔn)確加入25 mL 60％甲醇水溶液溶液，加塞輕輕振搖5 min，靜置分層，放出下層60％甲醇水提取液。 2、取提取液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 4．酒類(lèi) 1、稱(chēng)取5 g樣品于125 mL分液漏斗中，加入25 mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。 2、放出下層三氯甲烷層，取5 mL于20 mL蒸發(fā)皿中，65 ℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入5 mL 60％甲醇水溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解。 3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 5．花生 1、樣品去殼粉碎，稱(chēng)取5 g于100 mL具塞三角瓶中。加入25 mL 60％甲醇水溶液和20 mL正乙烷（或石油醚），振搖10 min，用whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾。 2、收集濾液于125 mL分液漏斗中，靜置分層后放出下層60％甲醇水提取液。 3、取提取液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混勻，再用whatman 1號(hào)濾紙過(guò)濾，此為樣品待檢液。 6．月餅、桃酥、花生醬等 1、稱(chēng)取5 g粉碎樣品于125 mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入25 mL 60％甲醇水溶液和20 mL正乙烷（或石油醚）加塞震蕩10 min，過(guò)濾，收集濾液于分液漏斗中，靜置分層。 2、待下層甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一三角瓶中。吸取10 mL甲醇水提取液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，取10 mL于20 mL蒸發(fā)皿中，65 ℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入5 mL 60％甲醇水溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解。 3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 7．面粉、飼料濃縮料 1、稱(chēng)取5 g樣品于125 mL具塞三角瓶中，準(zhǔn)確加入25 mL 60％甲醇水溶液加塞震蕩10 min，過(guò)濾，收集濾液。 2、吸取10 mL濾液于125 mL分液漏斗中，加入20 mL三氯甲烷，加塞振搖3 min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，取10 mL于20 mL蒸發(fā)皿中，65 ℃水浴通風(fēng)揮干。揮干冷卻后，準(zhǔn)確加入5 mL 60％甲醇水溶液，將蒸發(fā)皿中的凝結(jié)物充分溶解。 3、取溶解液2 mL，再加入6 mL 20％甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 ? 注意： 1、某些樣品待檢液(如花生等)久置會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，為保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，樣品提取后請(qǐng)即時(shí)檢測(cè)。 2、 若樣品待檢液不立即檢測(cè)，請(qǐng)將其存儲(chǔ)于棕色玻璃瓶?jī)?nèi)，2-8 ℃避光保存。 3、 試劑盒在使用前，請(qǐng)將試劑盒內(nèi)所有試劑放到室內(nèi)溫度（20-25 ℃）進(jìn)行溫度平衡；試劑用完后立即將其放置回2-8 ℃冰箱內(nèi)保存。 4、 在每個(gè)步驟操作時(shí)，速度要快，不要將板孔暴露在空氣中時(shí)間過(guò)久，避免酶標(biāo)板變干。未用完的酶標(biāo)板需密閉于自封帶內(nèi)，防止受潮且避光保存于2-8 ℃冰箱內(nèi)。 5、 溫育時(shí)，需避光，建議將酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)(在有蓋容器內(nèi)放置一塊平整濕紗布)進(jìn)行溫育。 ? 五、操作步驟： 1．將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2．按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷凍。 3．加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL /孔，然后加抗體工作液50 μL /孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，室溫下環(huán)境反應(yīng)40 min。 4．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 5． 加入100 μL酶標(biāo)記物應(yīng)用液到微孔板中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應(yīng)20分鐘。 6．棄去孔中的液體，并在吸水紙上拍干，每孔注滿(mǎn)稀釋好的濃縮稀釋液，輕輕振蕩，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)4次。 7．顯色：每孔加入底物緩沖液50 μL，再加底物液50 μL，輕輕振蕩混勻，室溫環(huán)境下避光顯色10 min。 8．測(cè)定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處（在20 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定吸光度值。 ? 六、結(jié)果判定 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以黃曲霉***B1(AFB1)標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中黃曲霉***B1(AFB1)的實(shí)際濃度。 ? 七、注意事項(xiàng) 1．室溫低于20 ℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（20-25 ℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。 2．洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。 3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。 4．反應(yīng)終止液為2 M**，避免接觸皮膚。 5．將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。 6．不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。 7．顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之，0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。 ? 八、儲(chǔ)藏條件和保質(zhì)期 儲(chǔ)藏條件：試劑盒于2-8 ℃?保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見(jiàn)包裝盒。