一、原理 本試劑盒采用直接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物恩諾沙星和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗恩諾沙星酶標(biāo)抗體，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物恩諾沙星的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物恩諾沙星的含量。 ? 二 、試劑盒技術(shù)指標(biāo) 試劑盒靈敏度：0.1 ppb 檢測下限 **樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）? ?? 1 ppb 血清樣本 ?????????????????????????????? 1 ppb 蜂蜜樣本????????????? ????????????????? 2 ppb 交叉反應(yīng)率 恩諾沙星???????????????????????????????? 100％ 環(huán)丙沙星???????????????????????????????? 1.25％ 諾氟沙星???????????????????????????????? 1.65％ 其它沙星類**交叉反應(yīng)率均小于0.1％ 樣本回收率 ?? ?**樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）???? 100±20％ ?? ?血清樣本??????????????????????? ??????? 100±20％ ?? ?蜂蜜樣本???????????????????????????????  90±15％ ? 三、試劑盒 組 成 1．微量測試孔：? 96孔，12條 2．標(biāo) 準(zhǔn) 液×6瓶： （1mL/瓶） 0 ppb、 0.1 ppb、0.3 ppb、 0.9 ppb、 2.7 ppb、 8.1 ppb 3．酶標(biāo)記物????????????????? 7 mL 4．底物緩沖液??????????????? 7 mL? 5．底物液　????????????????? 7 mL? 6．終止液??????????????????? 7 mL 7．20倍濃縮洗滌液?????????? 50 mL ????加蒸餾水后稀釋到1000 mL。 9．復(fù)溶液????????????????? ? 50 mL ? 四、樣本前處理步驟 ??樣本處理前須知： 1．實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。 2．實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。 ? 1.?動物**樣本（雞肉，魚肉，蝦肉，豬肉）） ??  1．魚蝦去皮取肉，用勻漿器均質(zhì)樣品； 2．稱1.0 g 均質(zhì)過的**樣本于50 mL離心管中； 3．加入含5％甲醇的復(fù)溶液2 ml，震蕩10 min； 4．5000 r/min以上離心10 min（如果上清液太渾濁需取出 2-4mL再次離心）； 5．取上清液，用復(fù)溶液稀釋5倍。震蕩均勻。 6．取50 μL用于分析。 樣本稀釋倍數(shù)：15 2?液態(tài)奶 稱取樣品5 mL，于10000 r/min離心10 min。撥去上層油脂，取上清液，用復(fù)溶液稀釋15倍。 震蕩均勻。取50 uL待測。 稀釋倍數(shù)15倍。 3?酸奶 稱取樣品5 g，于10000 r/min離心1 0min。取上清，用復(fù)溶液稀釋15倍。加入等量正己烷，輕輕混勻。5000 r/min離心10 min。去除上層正己烷，取下層清液50 uL待測。 稀釋倍數(shù)15倍。 4?肝臟 用勻漿器均質(zhì)樣品，稱取樣品1 g，加入復(fù)溶液3 mL，震蕩10 min。沸水浴10 min。5000 r/min離心10 min。取上清，用復(fù)溶液稀釋5倍。震蕩均勻。取50 uL待測。 稀釋倍數(shù)20倍。 5.?蜂蜜 1．取1 g蜂蜜，加入2 mL 0.02 M PB緩沖液，振蕩至蜂蜜全部溶解； 2．加入8 mL二氯甲烷，振蕩5 min，4000 r/min以上離心5 min； 3．輕吸掉上層，取下層有機相至干燥溶器中，50 ℃氮氣吹干/旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干； 4． 用1 mL復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，再用復(fù)溶液將其按1：3稀釋；? 5．取50 μL用于分析。 ?? 樣本稀釋倍數(shù)：4 ? 五、操作步驟： 1．將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫平衡30 min以上, 注意?? 每種液體試劑使用前均須搖勻。 2．按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷凍。 3．加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL /孔，然后加入酶標(biāo)液50 μL /孔，再振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，37℃環(huán)境反應(yīng)30 min(室溫下反應(yīng)40 min)。 4．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 5．顯色：每孔加入底物緩沖液50 μL，再加底物液50 μL，輕輕振蕩混勻，室溫或37℃環(huán)境避光顯色10 min。 6．測定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處（在20min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值。 ? 六、結(jié)果判定 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中恩諾沙星的實際濃度。 ? 七、注意事項 1．終止液為2M**，避免接觸皮膚。 2．不要使用已過有效日期的檢測試劑盒；不同批次、不同試劑盒之間的試劑等內(nèi)容不可混用，以免降低靈敏度。 3．0標(biāo)準(zhǔn)液的OD值小于0.6時，表示試劑可能變質(zhì)，請勿使用。 4. 顯色劑變藍，表明已變質(zhì)，請勿使用。 ? 八、儲藏條件和保質(zhì)期 儲藏條件：試劑盒于2-8 ?℃?保存，不要冷凍。 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。